Chinese Journal of Lung Cancer
中国肺癌杂志编辑部
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高分辨率熔解曲线法在BIM基因2, 903 bp片段插入/缺失检测中的应用
DOI 10.3779/j.issn.1009-3419.2014.03.10, Volume: 17, Issue: 3,

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Notes

Abstract

背景与目的BIM基因编码的蛋白属于BCL2蛋白家族的成员,作为凋亡调控因子参与多种细胞活动。BIM基因上2, 903bp的插入缺失片段与非小细胞肺癌EGFR-TKI靶向用药的获得性耐药相关。建立并优化HRM方法有助于快速、准确地检测BIM基因2, 903 bp片段的缺失,为临床工作提供指导性的意见。本研究建立与稳定了HRM的检测方法,并在30例肺癌样本以及30例正常对照样本中检测BIM基因缺失情况。方法设计、合成针对BIM基因片段缺失的引物,优化高分辨率熔解曲线(high resolution melting, HRM)分析方法。并选取部分样本通过普通PCR方法和直接测序法检测BIM基因缺失情况。野生型模板扩增产物其解链温度要高于缺失型产物的解链温度。野生型和缺失型产物的熔解曲线可见明显差异,相应的Tm值相差约2.5 ℃。结果经过HRM基因突变分析方法,在30例肺癌样本中检测到1例为BIM基因纯合缺失型,7例为杂合缺失型,22例为野生型。在30例正常对照样本中检测,2例为杂合缺失型,28例为野生型。结论本研究建立的对BIM基因片段缺失的高分辨率熔解曲线法是一种,灵敏、准确、快速、高通量的方法。

Keywords
高分辨率熔解曲线法在BIM基因2, 903 bp片段插入/缺失检测中的应用

BIM基因是编码细胞凋亡基因BCL2蛋白家族中的一个成员,在细胞凋亡中发挥重要的调节作用[1, 2]。研究[3]表明BIM基因外显子3和外显子4之间存在的2, 903 bp的缺失会造成BIM亚型BH3结构缺乏表达。而这种缺乏表达会导致癌症患者对部分治疗药物有更强的耐药性。在癌症患者体内,这种删除与药物反应的持续时间相关联,并且能够被用来预测患者在没有疾病恶化时的存活时间。携带这种删除突变的那些患者的平均无疾病恶化存活期限为大约6个半月时间,而没有这种突变的那些患者则为将近12个月。因此BIM缺失的检测对于癌症患者有相当重要的意义。

在本研究中,建立了一种高分辨率熔解曲线法(high resolution melting, HRM)来检测BIM基因片段缺失在肺癌患者中的发生情况,并用传统PCR方法对HRM检测结果进行验证。结果表明,建立了一种高分辨率熔解曲线法对于BIM基因2, 903bp片段插入/缺失检测是一种灵敏、准确、快速、高通量的方法。

1. 材料与方法

1.1. 病例样本

共检测30例肺癌样本。30例正常对照样本。其中30例肺癌样本来自于上海市胸科医院2012年8月-2013年8月入院治疗的晚期非小细胞肺癌患者(Ⅲa期-Ⅳ期)。患者签署知情同意书后,抽取5 mL外周血,使用EDTA抗凝管进行保存。30例正常对照样本来自上海市徐汇区社会体检人群,俱签署知情同意。

1.2. DNA提取

基因组DNA采用浓盐法[4]进行抽提。取200 μL全血放入1.5 mL离心管内,加入裂解液STE(Tris-Hcl 10 mM, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM)410 μL,10%SDS 90 μL,pk 5 μL在65℃消化15 h左右。充分消化后加入300 μL饱和NaCl轻摇3 min。加氯仿340 μL混匀后12, 000 rmp离心20 min。将上清液吸入另一离心管中,加异丙醇650 μL,4 ℃,12, 000 rpm离心16 min。倒掉异丙醇加500 μL 75%乙醇,4 ℃ 12, 000 rpm离心5 min,重复两次后烘干沉淀,加入70 μL Mili Q水溶解。提取的基因组DNA经Nanodrop定量,测定260/280值后,冻存备用。

1.3. 引物设计与合成

根据GenBank中人类BIM基因序列(Gene ID: 10018),设计HRM上游引物:ATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAG,HRM下游引物1:CCCAACCTCTGACAAGTGACC,HRM下游引物2:TTGGTGGGAATGTAAAATGGC。HRM引物设计原理见图 1。普通PCR上游引物:AATACCACAGAGGCCCACAG,普通PCR下游引物:GCCTGAAGGTGCTGAGAAAG。测序上游引物:CATAAATACCACAGAGGCCCACA GC,测序下游引物1:CCCAACCTCTGACAAGTG ACC,测序下游引物2:TTGGTGGGAATGTAAA ATGGC。

HRM检测BIM基因缺失引物设计原理
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HRM检测BIM基因缺失引物设计原理The principle of the HRM detection BIM gene deletion's primer design

1.4. HRM检测

PCR扩增和高通量熔解曲线分析在LightCycler® 480 Ⅱ荧光定量PCR仪(Roche)上进行,采用384孔反应模块。试剂使用LightCycler® 480 High Resolution Melting Master试剂盒,反应体系为10 μL,内含5 ng-10 ng基因组DNA、1×Master Mix、3.0 mmol/L MgCl2,引物浓度为0.2 μmol/L。

PCR扩增采用降落(touchdown)模式:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,65 ℃-55 ℃退火(每循环下降0.5 ℃)15 s,72 ℃延伸20 s的程序进行20个循环。之后再按95 ℃变性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s的程序进行25个循环。扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行,程序为:升温至95 ℃ 15 s,然后降温至40 ℃ 1 min,再升温至65 ℃ 1 s。从65 ℃连续升温至95 ℃的过程中进行荧光收集(20次/℃)。最后,降温至40 ℃。高分辨率熔解曲线分析用LightCycler® 480的Gene Scanning软件(1.5 version)进行。

2. 结果

2.1. HRM检测方法的建立与优化

根据BIM基因缺失情况与序列信息,设计相应的引物。同一个反应中存在两对引物,可能扩增出两种不同的产物。为使两种产物都得到较好的扩增,采取了降落(touchdown)模式对模板进行扩增。缺失型模板的扩增产物与野生型模板扩增产物相比GC含量略低,解链温度也较低。分析结果显示,野生型和缺失型的模板所产生的熔解曲线可见明显差异,相应的Tm值相差约2.5 ℃(图 2)。在HRM的灵敏度检测中,分析评估不同BIM突变浓度DNA的结果(0%、1%、2%、5%、10%、25%、50%稀释和100%的突变体)。该HRM方法可以很容易区分突变含量为5%的样本(图 3),比普通PCR以及直接测序更高。

野生型比缺失型的解链温度要高。经变换后的熔解曲线峰值温度差值约为2.5 ℃,区分十分明显(——野生型——缺失型)。
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野生型比缺失型的解链温度要高。经变换后的熔解曲线峰值温度差值约为2.5 ℃,区分十分明显(——野生型——缺失型)。The melting temperature of wild-type is higher than the deletion. Ater the data processing the significant difference of the melting curve peak temperature is about 2.5 ℃ (——wild type——deletion).
HRM检测BIM缺失灵敏度检测。1: 0%;2: 50%;3: 25%;4: 10%;5: 5%;6: 1%;7: 100%。
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HRM检测BIM缺失灵敏度检测。1: 0%;2: 50%;3: 25%;4: 10%;5: 5%;6: 1%;7: 100%。Sensitivity of the high resolution melting (HRM) analysis for detecting the BIM deletion. 1: 0% mutant; 2: 50% mutant; 3: 25% mutant; 4: 10% mutant; 5: 5% mutant; 6: 1% mutant; 7: 100%.

2.2. 30例肺癌样本、30例正常对照样本BIM基因缺失检测结果

应用建立的HRM检测法,对30例肺癌样本,30例正常对照样本进行BIM基因缺失检测。在30例肺癌样本中发现纯合缺失型样本1例,杂合样本7例,其余均为野生型样本;在30例正常对照样本中发现杂合样本2例,其余均为野生型样本。从以上纯合缺失型、杂合缺失型、野生型样本中各取2例进行测序和普通PCR鉴定,普通PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。

代表性的野生型、杂合缺失型和纯合缺失型的HRM与普通PCR检测结果如图 4所示,测序结果如图 5所示。图 45中a标本检测为野生型,b标本检测为杂合缺失型,c标本检测为纯合缺失型。

代表性野生型、杂合缺失型和纯合缺失型的HRM与普通PCR检测结果
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代表性野生型、杂合缺失型和纯合缺失型的HRM与普通PCR检测结果The typical results of the the wild-type, heterozygous and homozygous' HRM and ordinary PCR detection
代表性野生型、杂合缺失型和纯合缺失型的测序结果
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代表性野生型、杂合缺失型和纯合缺失型的测序结果The typical results of the the wild-type, heterozygous and homozygous' sequencing detection

3. 讨论

HRM可以检测扩增模板中的序列变化。该方法是通过检测与双链DNA结合的饱和荧光染料在变性升温过程中随着DNA解链时游离到体系中发生的荧光强度的减弱而实现的。与传统PCR以及测序方法相比较,此种方法可以在一步PCR反应中实现,无需延伸、无需进行电泳鉴定,有着快速、简便、重复性好、污染可能低的特性,而且只要是模板中有序列变化,都会使其熔解曲线发生变化,从而在高分辨率溶解曲线去得以体现,比传统PCR以及测序更灵敏[5, 6]

HRM能检测模板中存在的任何序列变化。这使得该方法不但可以检测特定位点的突变,还能筛查整个扩增序列的变化。

BIM基因对细胞凋亡的调节起着极为重要的作用[2, 7],在另外一项研究中发现BIM基因变异导致了某些患者无法受益于这些酪氨酸激酶抑制剂药物。药物耐受主要是BIM突变导致BIM蛋白生成受损。而使用BH3药物修复BIM基因功能就可能克服两种癌症类型的TKI耐受[3]。以上研究表明,BIM是个癌症耐药基因。Ng等[3]的研究中对BIM基因上2, 903 bp的indel的检测使用的方法为琼脂糖凝胶电泳方法,和本文阐述的HRM方法相比,凝胶电泳所需时间更长、检测需要开放式进行可能引入污染和交叉污染的机会,同时凝胶成像使用肉眼观察,如果PCR产物浓度较低会导致错误读取。相比,HRM方法使用荧光染料检测,灵敏度更高,原管检测避免了开管检测可能引入的污染机会,PCR反应完成后仅需要5 min-10 min进行熔解曲线检测,更方便快捷。本研究建立的对BIM基因2, 903 bp片段缺失的HRM是一种灵敏、准确、高效、快速、低污染的检测方法。

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https://www.researchpad.co/tools/openurl?pubtype=article&doi=10.3779/j.issn.1009-3419.2014.03.10&title=高分辨率熔解曲线法在<i>BIM</i>基因2, 903 bp片段插入/缺失检测中的应用&author=&keyword=高分辨率熔解曲线法,BIM基因,肺肿瘤,High resolution melting curve method,BIM gene,Lung neoplasms,&subject=临床研究,Clinical Research,